Bakgrunn http://www.ntnu.no/~cathd/

Et av hovedproblemene ved konvensjonell kreftbehandling som stråleterapi og kjemoterapi, er at behandlingene ikke er spesifikke for kreftcellene. Den ioniserende strålingen og cellegiften ødelegger både normalt vev og kreftvev, og skadene på normalt vev begrenser dosene som kan benyttes.

Ulike strategier for å utvikle kreftspesifikke behandlinger er foreslått. Utviklingen av monoklonale antistoffer som binder seg til kreftspesifikke antigener på overflaten av kreftcellene gav håp om en ny og kreftspesifikk behandling. Monoklonale antistoffer kan benyttes som bærere for radioaktive isotoper, toksiner eller andre giftstoffer. Genterapi basert på DNA vektorer som bærer terapeutiske gen kan bli en annen kreftspesifikk behandling. Liposomer benyttet som bærere av cellegift reduserer toksisiteten til normalt vev og øker spesifisiteten for kreftvev, er et annet eksempel på bruk av makromolekyler. Felles for alle disse behandlingene er at det benyttes store molekyler med en diameter i størrelsesorden 10 til 10.000nm, mens konvensjonelle cellegifter små molekyler med diameter under 1 nm. Slike store molekyler har problemer med å nå fram til kreftcellene, og det er vist at bare en liten del av makromolekylene som injiseres intravenøst eller gis oralt når fram til kreftvevet. Om de skal lykkes å nå fram og drepe kreftcellene avhenger av at det er et godt utviklet blodårenettverk i svulsten, at molekylene kan passere over kapillærveggen og at de er i stand til å trenge gjennom rommet mellom kreft cellene (kalt ekstracellulær matrix (ECM) eller interstitium). Disse transportetappene avhenger av diffusjon der fluksen av molekylet er proporsjonal med konsentrasjonsgradienten og konveksjon der fluksen av molekylet er proporsjonal med den hydrostatiske trykkgradienten. Det er vist at svulster har et høyere interstitielt væsketrykk enn normalt vev, og dette er et av hovedproblemene for å få makromolekyler fram til kreftcellene. Diffusjon kan derfor være den primære transportmekanismen. Diffusjon er imidlertid en ekstrem sein prosess for store molekyler og diffusjonskoeffisienten avtar med økende molekylvekt.

1. Diffusjon av ladete makromolekyler i geler.

Diffusjon er den primære transportmekanismen dersom det høye interstitielle væsketrykket umuliggjør transport av molekyler basert på trykkgradienten. I denne oppgaven blir negativt ladete geler benyttet som en modell for ekstracellulær matrix i en svulst.

Formål: Kartlegge betydningen som ladning på makromolekylene har for diffusjon gjennom en ladet ekstracellulær matrix .

Metode: Negativt ladete geler blandes med fluorescensmerkede antistoff (IgG )som anioniseres og kationiseres. Diffusjon måles med teknikken ” fluorescence recovery after photobleaching” (FRAP).

2. Intracellulær trafficking av kitosan/DNA nanopartikler: fotokjemisk internalisering teknologi for økt levering av genmedisiner

Medveileder: Sabina Strand, Inst for bioteknologi, (tlf. 91689)

Formål: Genoverføring er en nøkkelteknikk i moderne bioteknologi og har et potensiale som terapi i forbindelse med genetisk betingede sykdommer (genterapi). Den største bremsen i klinisk anvendelse av genterapi er mangel på effektive og trygge genleveringsystemer. For at DNA kan overføres (transfekteres) til celler og uttrykke ønsket protein, må den effektivt kondenseres ("pakkes inn") enten i et virus eller en syntetisk nanopartikkel vha positivt ladede polymerer eller lipider. I disse nanopartiklene blir terapeutisk gen beskyttet mot nedbrytning og lettere transportert inn i cellene. Etter celleopptak ved endocytose må nanopartiklene passere flere intracellulære barrierer på vei til cellekjernen, hvor DNA kargo skal frigjøres for transkripsjon.

En av de største flaskehalser i en transfeksjonsprosess er frigjøring/utslipp av nanopartikler fra endosomer og lysosomer. Flere studier viser at store mengder DNA aldri blir frigjort og brutt ned i lysosomene. Fotokjemisk internalisering (PCI) er en teknologi som utnytter såkalte photosensitizers for lys-indusert frigjøring av makromolekyler fra endosomer og lysosomer. Når cellene blir eksponert for lys vil photosensitizeren som er tatt opp i lysosomer føre til at lysosomene sprekker og innholdet kommer ut i cytoplasma.

Inst for bioteknologi har gjennom mange år jobbet med utvikling av genvektorer basert på kitosan. Kitosan, et naturlig forekommende polysakkarid som fremstilles fra krabbe- og rekeskallet, er en meget lovende bærer for DNA. For videre utvikling av enda mer effektive vektorer trenger vi bedre forståelse av intracellulær trafficking av kitosan/DNA nanopartikler. I dag fremstår intracellulær transport som en ”black box”, vi vet lite om hvilke trinn som er de mest kritiske i overføringsprosessen. Det er spesielt uklar hvordan kitosan/DNA nanopartikler unnslipper fra endosomer/lysosomer. Ved å implementere PCI teknologi, kan vi muligens både øke trasfeksjonseffektivitet og samtidig få bedre forståelse av hvorvidt frigjøring av vektorer fra endosomer/lysozomer er en begrensende faktor for genlevering.

Metoder: Kitosan/DNA nanopartikler vil bli lokalisert i celler og kolokalisert med lysosoner, cytoplasma, og kjerne ved bruk av konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM). Videre kan flow cytometry brukes til å kvantifisere opptak av komplekser og levedyktighet.